TÉCNICA DE EDICIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS.

Título: Hemofilia A mejorada en ratones mediante la edición del genoma in vivo basada en CRISPR del factor VIII humano.

Tipo de Edición: In vivo, somática.

Dirigido hacia: integrar el BDD-F8 humano de una manera específica de sitio en el locus de albúmina específica del hígado del ratón, lo que lleva a la producción de FVIII en el hígado.

Dirigido por:

• ·    CRISPR / Cas9
• ·    Nucleasa de dedos de zinc (ZFN)
• ·    Nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN)
• ·    Dos vectores raav, que codifican el ARN guía de Staphylococcus aureus Cas 9 (sacas9-grna) y un FVIII humano con codón optimizado con el dominio B eliminado (BDD-F8), respectivamente.

Órgano a tratar: Células hepáticas del hígado.

Vía de administración: Inyecciones en la vena de la cola.

Resultados: Este tratamiento mejoró el fenotipo de la enfermedad, promoviendo niveles elevados de proteína y actividad de FVIII en el hígado hasta por 7 meses, sin toxicidad hepática discernible.

Enlace Bibliográfico: 

https://www.nature.com/articles/s41598-019-53198-y

 

TERAPIA COM STEM CELL EN HEMOFILIA A.

 Título: Las células endoteliales derivadas de iPSC específicas del paciente brindan una corrección fenotípica a largo plazo de la hemofilia A.

Tipo de Stem Cell: Células endoteliales (células madre pluripotentes).

Método de obtención: Se generó  células madre pluripotentes inducidas libres de  enfermedad (iPSC) específicas del paciente a partir de células CD34 + de sangre periférica y las diferenciaron en células endoteliales funcionales (CE) que secretan factor VIII (FVIII) para enfoques de terapia génica y celular para curar la hemofilia A (HA).  Las CE pueden obtenerse de las iPSC derivadas de CD34 + con mayor eficiencia utilizando el protocolo que incluye BMP4 y VEGF.

Vía de administración: inyección en un modelo de ratón de HA.

Resultados: Las células trasplantadas injertaron y proliferaron en el hígado a lo largo de los sinusoides, a largo plazo mostró una actividad terapéutica estable del FVIII (6%). Estos resultados demuestran que el fenotipo hemofílico se puede rescatar mediante el trasplante de CE derivadas de iPSC corregidas con HA FVIII, lo que confirma la viabilidad de la estrategia de reprogramación celular en células derivadas de pacientes como un enfoque para terapia celular y génica HA.

Enlace Bibliográfico:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6294075/

ADN RECOMBINANTE Y TRANSGENICOS.

 RECOMBINACIÒN DE ÀCIDOS NUCLÈICOS EN LA NATURALEZA

El ADN recombinante contiene  genes o partes de  genes de diferentes organismos, en muchos casos de distintas especies. El ADN se recombina de forma natural mediante procesos como la reproducción sexual, la transformación bacteriana y la infección viral. Las bacterias sufren varios tipos de recombinación que hacen posible la transferencia de genes entre especies no afines, por medio de un proceso conocido como transformación el cual permite a las bacterias capturar ADN libre del ambiente. También puede haber transformación cuando las bacterias capturan diminutas moléculas circulares de ADN llamadas plásmidos.  Cuando la bacteria muere, libera estos plásmidos en el ambiente, donde pueden ser capturados por bacterias de la misma especie o de otra diferente.

ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

Los métodos de determinación del perfil del genotipo F8 están bien establecidos, lo que facilita la identificación de los tipos de mutación asociados con la enfermedad, así como las interacciones moleculares de HA. Sin embargo, se sabe poco sobre la relación entre los genotipos F8 y sus fenotipos expresados. Además, no está claro cómo las mutaciones específicas de F8 influyen en la actividad del FVIII y / o las interacciones proteína-proteína. Para comprender mejor estos mecanismos, es útil generar polipéptidos correspondientes a dominios de FVIII que sean detectables por anticuerpos específicos de dominio. Por lo tanto, se ha clonado cada dominio de F8 a partir de hepatocitos Hep3B y produjeron proteínas recombinantes específicas del dominio de FVIII.

 

EJEMPLO DE TRANSGÉNICO ANIMAL

Los métodos de fabricación actuales para el factor VIII humano recombinante (rFVIII) en cultivos de células de mamíferos son ineficaces, lo que dificulta la producción de cantidades suficientes para el tratamiento asequible y mundial de la hemofilia A. Sin embargo, las glándulas mamarias transgénicas han expresado rFVIII en niveles muy altos de ratones, conejos, ovejas y cerdos. Se crearon ratones transgénicos con un gen de FVIII específico mamario  (226 / N6), en donde la actividad hemostática del 226 / N6 se ha enriquecido con inmunoafinidad, lo cual fue estudiado in vivo mediante infusión en ratones knockout para la hemofilia A.

Enlaces Bibliográficos: 

https://books.google.com.ec/books?id=uO48-6v7GcoC&pg=PA244&lpg=PA244&dq=adn+recombinante+en+la+naturaleza+transformaci%C3%B3n&source=bl&ots=vVqAHQZIRB&sig=-QJw5I9BjZm9C7db__gebXtDxGY&hl=es&sa=X&ei=8PSfUNaCHZOC8QS5z4HwCQ&ved=0CCQQ6AEwAQ#v=onepage&q=adn%20recombinante%20en%20la%20naturaleza%20transformaci%C3%B3n&f=false

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4486152/

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1538-7836.2011.04505.x

TÉCNICA MOLECULAR EPIGENÓMICA.

 Estudiamos uno de los puntos críticos de inversión en Xq28, lo que conduce a la interrupción del gen F8 y da como resultado el fenotipo de hemofilia A. Para determinar la consecuencia epigenética de este reordenamiento, evaluamos los niveles de metilación del ADN de 12 regiones ricas en CpG con una cobertura de 550 kb mediante el uso de un ensayo de enriquecimiento de re-secuenciación de bisulfito basado en secuenciación de bisulfito y pirosecuenciación de próxima generación. En este estudio, aprovechamos el modelo de inversiones del gen F8 para analizar los niveles de metilación del ADN de las regiones ricas en CpG dentro y flanqueando las regiones de ADN invertido en ADN de tipo salvaje he invertido (con inversiones del intrón 1 o del intrón 22).  Los resultados muestran cambios claros de metilación del ADN detectables asociados con inversiones que flanquean las regiones invertidas. Las aberraciones de metilación son una herramienta de diagnóstico útil para identificar variaciones estructurales de inversión.

Enlace bibliográfico:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6548806/

PRUEBA DE TAMIZAJE Y UNA CONFIRMATORIA

Se han utilizado varios abordajes moleculares para la identificación de mutaciones en los exones y en uniones intrón-exón en pacientes con Hemofilia A. Estas metodologías consisten en un tamizaje genético para la identificación de alteraciones en la secuencia del ADN amplificado. El primer análisis de la secuencia del gen del Factor VIII con estas metodologías se llevó a cabo en 1991 mediante DGGE. Este abordaje muestra una tasa de detección del 90% de las muestras analizado. Esta metodología presenta ventajas permitiendo un análisis rápido en tiempo real y con costos muy por debajo de otras metodologías.

Prueba Confirmatoria.

Un diagnóstico molecular constituye la prueba confirmatoria de la enfermedad, para la detección de portadoras de hemofilia A se realiza un diagnóstico directo e indirecto. En el diagnóstico directas se menciona Southern blot, la amplificación simultánea mediante PCR y secuenciación. El diagnóstico indirecto se basa en la construcción de haplotipos utilizando diversos marcadores moleculares polimórficos intra y/o extragénicos sobre todo short tandem repeats (STR) que pueden o no estar ligados a una mutación, por lo que, no proporcionan información fiable respecto al tipo de mutación causante de la hemofilia.

Enlace Bibliográfico: 

https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/handle/unal/58750/LuzK.YunisHazb%C3%BAn.2016.pdf?sequence=1&isAllowed=y