PRUEBA DE SECUENCIACIÓN.

Esta técnica consiste  en el bloqueo de la síntesis de una nueva cadena de ADN para lo cual se usa dideoxinucleótidos (ddNTPs), deoxinucleótido modificados, para completar el nucleótido específico utilizando como molde una cadena sencilla de la región de la cual se desea obtener la secuencia. Para el análisis de la hemofilia A, la secuenciación presenta una alta sensibilidad que ha permitido la detección directa de las mutaciones presentes en el gen F8. Los métodos de Secuenciación de Nueva Generación se han convertido en la metodología de elección para la rápida identificación de las mutaciones existentes en Hemofilia A. La secuenciación del ADN han permitido analizar genomas completos o parciales a nivel de su secuencia nucleotídica. 

Enlace Bibliográfico:

http://repositorio.puce.edu.ec/bitstream/handle/22000/12170/Disertaci%c3%b3n%20final_Lema%20Marisol.pdf?sequence=1&isAllowed=y

PRUEBA DE REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA EN HEMOFILIA A.

TEMA: PCR inversa para realizar haplotipos a larga distancia: principales aplicaciones para mejorar el diagnóstico genético preimplantacional en hemofilia.

OBJETIVO: Identificar las multialelas de la repetición en tándem corta (STR) F8 Int21,  en el F8- intrón 21, como un marcador de ADN sustituto para el F8-intron 22 inversión (Inv22), la    zona activa causante de la hemofilia A.

MUESTRA: Sangre periférica.                                     

ÁCIDO NUCLEICO: ADN genómico.    

GEN: Gen del factor VIII.

TIPO DE PCR: Amplificación de PCR inversa.

DESNATURALIZACIÓN: 94°C durante 3 min.

HIBRIDACIÓN: 52°C durante 1 min.

ELONGACION: 72°C  durante 6 min.

VISUALIZACION: Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñida con bromuro de etidio.

Referencias Bibliográficas: 

https://www.nature.com/articles/s41431-018-0334-9?fbclid=IwAR28BD-JHoARzPaaJlXl7IGJ7N64y0YsBVn1mFeU9isfLAuZMAba9AaDzqE

ALTERACIONES EN LA EPIGENÉTICA.

El gen que codifica al FVIII es uno de los más grandes y se localiza en la región Xq28, en la porción telomérica distal del brazo largo del cromosoma X. La metilación del ADN en dinucleótidos CpG es uno de los mecanismos epigenéticos implicados en la regulación de la expresión génica. Los grandes rearreglos involucran una inversión; en donde, los de mayor importancia  son los que ocurren en los intrones 1 o 22, los cuales presentan metilación anormal en los sitios  CpG. Estas dos inversiones son un modelo adecuado del efecto de las inversiones en la expresión génica, así como la estructura de la cromatina y las modificaciones epigenéticas. El dinucleótido CpG es susceptible de ser metilado en la  citosina a lo largo de todo el genoma, y por tanto, este proceso es una causa común de mutación en el genoma humano.

 Referencias Bibliográficas:

http://revhematologia.sld.cu/index.php/hih/article/viewFile/810/622

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/550566v1.abstract